一种植物病毒检测新方法—纳米上转换荧光技术

随着大豆进口量的日益增加,大豆携带病毒传入我国的风险在不断增大,高效、快速地进行植物病毒检测,防止外来有害生物入侵,是目前各口岸植物检疫工作的重点。本文介绍了一种植物病毒检测的新方法—纳米上转换荧光技术。该技术是一种利用磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNP)进行病毒分离、富集和定位;同时引入上转换荧光(up converting phosphor, UCP)材料作为标记物的免疫检测方法,具有高度的抗干扰性、多元性、稳定性和安全性等特点。     

进境哈萨克斯坦向日葵种子中向日葵黑茎病菌的鉴定

自进境哈萨克斯坦向日葵种子中,采用常规平板分离法获得1株疑似向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii菌株LL4,通过生物学性状、ITS序列测定和比对分析及致病性测定等方法对其进行了鉴定。结果表明,该病菌在PDA平板上培养初期菌丝无色,分隔分枝多,后期菌丝褐色或深褐色,常膨大;分生孢子器暗褐色,分散或聚集,球形、近球形或不规则形,大小为71.2~361.8μm;分生孢子形态变化较大,无色,单孢,肾形至椭圆形,大小为3.6~8.2μm×2.2~3.7μm,常含有2个油球;培养期间未见有性阶段。基于ITS序列分析比对发现,菌株LL4与Gen Bank中多个向日葵黑茎病菌分离物序列同源性达99%以上,系统进化树显示其与其它向日葵黑茎病菌分离物聚在同一个分支。菌株LL4可侵染向日葵根茎部,造成典型黑茎病症状。表明分离获得的菌株LL4为向日葵黑茎病菌P.lindquistii。     

南极磷虾木瓜蛋白酶酶解产物的营养学评价

分析了经1.5%木瓜蛋白酶55℃酶解3 h后的南极磷虾(Euphausia superba)蛋白酶解产物(上清和沉淀)的营养组成。结果显示:南极磷虾水解度为44.24%;上清冻干物(FDS)中粗蛋白和总糖含量分别为67.13%和13.91%,其必需氨基酸总量(ΣEAA)、鲜味氨基酸总量(ΣDAA)、牛磺酸Tau含量及F值(支链氨基酸/芳香族氨基酸)较酶解前分别提高了8.96%、6.06%、39.10%和16.67%,表明其氨基酸营养价值较酶解前要高。沉淀冻干物(FDP)中粗蛋白和总糖含量分别为44.49%和10.40%,而粗脂肪含量高达33.28%。FDP中总氨基酸含量(ΣAA)、ΣEAA、ΣDAA、Tau含量及F值均下降,但其ΣEAA在ΣAA中的比例高于40%,且8种EAA含量评分均高于FAO/WHO评分模式要求。脂肪酸分析结果表明,FDP中含有饱和脂肪酸(SFA)8种(44.81%),单不饱和脂肪酸(MUFA)6种(27.55%),多不饱和脂肪酸(PUFA)7种(27.64%),二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA含量较丰富。研究认为在本实验条件下通过木瓜蛋白酶酶解南极磷虾得到的FDS和FDP具有较高的利用价值,可开发为人类重要的蛋白来源。     

2009年－2019年全国口岸进口大麦中检疫性有害生物截获情况分析

为给进口大麦中检疫性有害生物截获策略提供参考,本研究统计了全国口岸2009年-2019年大麦进口基本情况,比较并分析了不同来源国(或地区)大麦中截获杂草、软体动物、真菌、昆虫、病毒等检疫性有害生物的种类数和种次数。结果表明,近11年来我国大麦进口量呈波动上升的趋势,其中2015年大麦进口量最大。截至2019年,大麦中截获检疫性有害生物共计70种,包括杂草53种、软体动物2种、真菌5种、昆虫8种、病毒2种,其中疫情最突出的是杂草。从来源国来看,澳大利亚、法国、加拿大、乌克兰是截获检疫性有害生物种类及种次数最多的国家。其中,澳大利亚、法国大麦中主要截获杂草、软体动物、真菌等有害生物,加拿大大麦中主要截获杂草、真菌及病毒,乌克兰大麦则主要截获杂草、软体动物及昆虫。本研究汇总了2009年-2019年不同来源国(或地区)进口大麦中截获检疫性有害生物的名单,为进口大麦检疫工作提供参考。     

基于TaqMan MGB探针的可可花瘿病菌快速检测方法

可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段?     

百日草炭疽病病原菌的分离鉴定及防治药剂筛选

为明确百日草炭疽病的病原菌,依据柯赫氏法则,对采集的病叶进行病原物分离并进行分离菌株致病性试验。确定菌株的致病性后,结合菌落形态,初步判断其为炭疽菌。运用分子生物学方法,扩增获得肌动蛋白基因 (actin gene, ACT)、几丁质合酶基因 (chitin synthase A gene, CHS)、磷酸甘油醛脱氢酶基因 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、核糖体内部转录间隔区 (ribosomal internal transcribed spacer, ITS)、锰超氧化物歧化酶 (manganese-superoxide dismutase, SOD2)、谷氨酰胺合酶 (glutamine synthatase, GS)、微管蛋白 (beta-tubulin-TUB2) 以及钙调蛋白 (calmodulin, CaM ) 8个基因序列,进行联合系统发育分析,确定该菌为暹罗刺盘孢菌Colletotrichum siamense。离体抑菌活性测定结果表明,9种杀菌剂制剂75%肟菌 ? 戊唑醇水分散粒剂、35%氟菌 ? 戊唑醇悬浮剂、75%百菌清可湿性粉剂、250 g/L嘧菌酯悬浮剂、50%咪鲜胺可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、10%丙硫菌唑悬浮剂、500 g/L氟啶胺悬浮剂和25%溴菌晴可湿性粉剂对供试病原菌的EC₅₀值分别为0.152、0.407、2.48、252、0.0342、0.556、317、0.00291和27.4 mg/L,其中500 g/L氟啶胺悬浮剂和50%咪鲜胺可湿性粉剂抑菌活性最强。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

逆转录环介导等温扩增技术检测草莓潜隐环斑病毒的研究

采用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,建立了草莓潜隐环斑病毒（Strawberry latent ringspot virus, SLRSV）检测方法。根据SLRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过逆转录环介导等温扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对SLRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度比普通RT-PCR高出100倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中65 ℃等温扩增,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

2种常见伞滑刃线虫的特异PCR检测方法

包括松材线虫和椰子红环腐线虫在内的伞滑刃属线虫形态上相似性高,形态鉴定难度较大。本文通过对伞滑刃属常见线虫群体ITS2区序列比对、分析,设计了木质包装材料检疫中常见的泰国伞滑刃线虫和豆伞滑刃线虫特异引物对各1对,并研究了这2种常见伞滑刃线虫的PCR检测方法,使用本文特异引物可分别特异、快速检测出这两种线虫。     

进境澳大利亚大麦上葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

自进境澳大利亚大麦样品上,采用常规平板分离法获得1株疑似葡萄茎枯病菌菌株74919。通过形态学特征观察、β-tubulin和actin序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株74919在PDA培养基上生长良好,可产生大量分生孢子器和厚垣孢子;基于β-tubulin和actin序列构建的系统发育树中,菌株74919和其他葡萄茎枯病菌相关序列划分在同一分支;菌株74919接种大麦叶片,在接种部位引起叶斑症状。根据上述实验结果,将菌株74919鉴定为葡萄茎枯病菌(Didymella glomerata),这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获葡萄茎枯病菌。